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        操作凍存管請嚴格按照使用說明來哦

        發布時間:2022-05-16      點擊次數:619
          使用凍存管儲存樣本時,嚴格要求應把凍存管放入液氮的氣相層或冰箱中保存!如果凍存管儲存于液氮液體中,液氮有一定幾率會滲入凍存管內部,復蘇時液氮氣化導致管內外壓力不平衡,這樣極易造成凍存管的炸裂,并具有生物危害性。
          操作凍存管復蘇,全程使用安全防護設備,建議穿實驗服、戴棉質手套且在安全的實驗臺上進行操作。條件允許情況下,請佩戴護目鏡或防護面罩。由于夏季室內溫度會高于冬季,請格外小心。
          凍存管使用不當,會有爆管、生物安全威脅及人身傷害等風險,請嚴格參照安全使用須知操作!
          01細胞凍存流程
          1、用預熱過的 PBS 對細胞進行沖洗,棄去 PBS 后,加入含 EDTA 的胰酶消化液對細胞進行消化(消化液薄薄地覆蓋細胞表面即可,消化液濃度須根據不同的細胞系進行調整)。
          2、37℃消化細胞 3–5 分鐘,不可過度消化。
          3、一旦細胞從底部脫離,即可用含血清培養基終止消化,并用吸管輕輕吹打以重懸細胞。
          4、離心(500 × g, 5 min)細胞重懸液以沉淀細胞,棄上清,用含血清培養基對細胞沉淀進行重懸。
          5、對細胞進行計數(推薦 Neubauer chamber)。
          6、離心(500 × g, 5 min)細胞重懸液,棄上清。用適當體積含血清培養基重懸細胞。
          7、將細胞重懸液以 1:1 比例與凍存液(60% 培養基,20% FCS,20% DMSO) 進行混合后轉移至 Cryo.sTM 凍存管中。凍存管中細胞的濃度應為 1–5 ×10^6細胞/ml。
          8、含有細胞的凍存管須按照 −1 K/min 的冷卻速率進行冷凍。將凍存管插在含異丙醇的凍存盒小室并放置在−70℃的冰箱中可以實現上述要求。如果 凍存液中含有其他類型的樣品時,則需要將 Cryo.s 凍存管在−20℃,−70℃或者液氮的氣相層進行直接凍存。為確保每個樣品的均一凍存效 果,4 ml 和 5 ml 的 Cryo.s凍存管需在−20℃過夜凍存后再轉移至 70℃或者液氮的氣相層。
          9、然后將 Cryo.s 凍存管轉移至液氮罐。為避免污染(例如支原體)并考慮到安全預防規范的要求,建議將 Cryo.s 凍存管放置在液氮上方的氣相層而非液氮層。
          02細胞復蘇流程
          1、從液氮罐中取出凍存管后立即將其置于 37℃水浴中進行解凍,解凍時間約 1–2min,解凍時需要不停搖動凍存管令其盡快融化。此步解凍過程越快越好。
          2、將解凍好的細胞懸液轉移到 15 ml 離心管,并立即添加一定量含血清培養基進行混合。
          3、離心(500 × g, 5 min)細胞重懸液,棄去上清。用適當體積的含血清培養基對細胞沉淀進行重懸后分裝到 1 個或多個細胞培養瓶中。
          4、請遵循細胞接種時的推薦濃度進行培養。
          5、接下來的 12 個小時細胞需要靜置培養。
          6、細胞換液可在 24–48h 后進行。
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